Die qPCR-Methode – Ein PCR-Test in Echtzeit
Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), auch bekannt als Echtzeit PCR-Test, ist eine molekularbiologische Methode zur Vervielfältigung und quantitativen Analyse von DNA- oder RNA-Sequenzen.
Sie ermöglicht die genaue Bestimmung der Anfangsmenge des Zielsequenzmaterials und hat breite Anwendungen in Forschung, Diagnostik und anderen Bereichen.
Was ist die qPCR-Methode?
Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist eine äußerst leistungsfähige Technologie, die es ermöglicht, geringe Mengen an DNA-Sequenzen zu vervielfältigen und gleichzeitig die Menge an Kopien zu bestimmen.
Wie funktioniert die qPCR-Methode
Zunächst wird genetisches Material (RNA oder DNA) aus der Probe isoliert. Das isolierte Material wird in ein Reaktionsgefäß gegeben und in einem speziellen Thermocycler auf verschiedene Temperaturen erhitzt und wieder abgekühlt. Dieser Prozess wird als Zyklus bezeichnet und besteht aus drei Schritten: Denaturierung, Hybridisierung und Elongation.
Handelt es sich bei dem genetischen Material um RNA, wie bei vielen Viren, muss diese zunächst in cDNA umgeschrieben werden, da PCR Methoden nur mit DNA funktionieren. Das übernimmt ein Enzym namens Reverse Transkriptase (RT), darum findet bei der RT-qPCR, welche RNA als Ziel hat (z.B Corona, RSV, Influenza), der RT-Schritt noch vor der eigentlichen PCR statt.
Denaturierung – Trennung der DNA
Bei der Denaturierung wird die doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge aufgetrennt, indem sie auf eine hohe Temperatur (in der Regel etwa 90 °C) erhitzt wird. Beim anschließenden Abkühlen auf etwa 60 °C binden die im Reaktionsgemisch enthaltene Primer und Sonden an bestimmte Stellen auf der DNA (oder cDNA). Das beschriebt die sogenannte Hybridisierung.
Hybridisierung – Verbinden von DNA mit den Primern
Bei der Hybridisierung werden nach dem Abkühlen die erregerspezifischen Primer an die DNA gebunden, um die gewünschte DNA-Sequenz zu amplifizieren.
Primer sind kurze Nukleotidsequenzen, die als Startpunkte für die Polymerase dienen. Die Sonden sind ebenfalls kurze Nukleotidsequenzen, die im inneren Bereich der Zielsequenz binden und an einem Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff und am anderen mit einem Fluoreszenzunterdrücker, dem Quencher, versehen sind.
Solange Quencher und Farbstoff nah beieinander liegen, gibt es kein Fluoreszenzsignal.
Das Fluoreszenzsignal
Wird kein Fluoreszenzsignal gemessen, bedeutet das, dass die genetische Zielsequenz nicht in der Probe war, die Ausgangsprobe also negativ war. Wird hingegen ein Fluoreszenzsignal in dem entsprechenden Kanal gemessen, war die Probe positiv.
Moderne qPCR-Geräte haben mehrere Fluoreszenzkänale, sodass mehrere, mit unterschiedlichen Fluoreszensfarben markierte Zielsequenzen in einer Reaktion getestet werden können.
Wiederholen des Zyklus und Bestimmung des Ergebnisses
Nachdem nun die ersten Schritte der qPCR-Methode abgeschlossen sind wird der Zyklus wiederholt.
Durch das Wiederholen des Denaturierungs-, Primer-Hybridisierungs- und Elongations-Schritte erhöht sich die Mengen an erregerspezifischen Sequenzabschnitten und damit stiegt das Fluoreszenzsignal exponentiell an.
Sind Erreger-DNA/RNA in der Ausgangsprobe enthalten, wird ein Fluoreszenzsignal gemessen. Wird kein Fluoreszenzsignal gemessen, befand sich auch keine Erreger-DNA/RNA in der Probe.
Warum ist die qPCR eine so mächtige Technologie?
Die qPCR-Methode hat unser Verständnis von DNA/RNA-Analysen revolutioniert und ist mittlerweile in vielen Bereichen der Forschung und Medizin unverzichtbar geworden.
Die PCR ermöglicht es uns, winzige Mengen an DNA zu vervielfältigen und genauer zu analysieren. Dadurch können wir Krankheiten schneller diagnostizieren, genetische Veränderungen aufdecken und sogar kriminaltechnische Untersuchungen durchführen.
Aber nicht nur das – die PCR hat auch dazu beigetragen, dass wir heute mehr über die Evolution und Verwandtschaftsverhältnisse von Lebewesen wissen. Kurz gesagt: Die PCR ist eine Technologie, die uns hilft, die Welt um uns herum besser zu verstehen und Probleme schneller zu lösen.
